對(duì)同一張組織切片上的兩種或多種抗原進(jìn)行免疫組化定位，有多種酶學(xué)方法可供選擇。概括起來可分為兩大類： 
用相同的酶系統(tǒng)、不同的酶作用底物對(duì)每種抗原進(jìn)行檢測(cè)，或用不同的酶系統(tǒng)及其相應(yīng)的底物，對(duì)每種抗原進(jìn)行檢測(cè)。 
目前Vector公司（國(guó)內(nèi)代理商欣博盛生物）所提供的可廣泛選擇的VECTORSTAIN® ABC kit試劑盒及底物試劑盒，上述兩種方法都適用。 
Vector開發(fā)的許多獨(dú)-特的底物尤其適用于多抗原標(biāo)記。通常，過氧化物酶底物能產(chǎn)生更穩(wěn)定、更密集的有色沉積物而能對(duì)抗原進(jìn)行精確定位；堿性磷酸酶底物較彌散；葡萄糖氧化酶相比而言靈敏度較低，但當(dāng)使用高濃度的一抗時(shí)，也可作為第二種標(biāo)記對(duì)抗原進(jìn)行定位。 

雙抗原染色流程圖 

雙抗原染色實(shí)驗(yàn)步驟 

1.組織標(biāo)本制備。脫蠟、水化、抗原修復(fù)（可根據(jù)一抗說明書推薦方法進(jìn)行操作）。 
2.在蒸餾水中清洗5分鐘。 
3.如存在內(nèi)源酶活性，可采用適當(dāng)方法以消除內(nèi)源酶的作用。（如3％H2O2-甲醇液中浸泡10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化氫酶的作用）。 
4.用PBS洗2 分鐘/次×3次（也可使用其他緩沖液）。 
5.Avidin/biotin封閉。 如有需要，可進(jìn)行Avidin/Biotin封閉（Avidin/Biotin 封閉試劑盒，目錄號(hào) SP-2001）。在Avidin溶液中孵育15分鐘。用緩沖液清洗，然后在Biotin 溶液孵育15分鐘。用PBS洗2 分鐘/次×3次。如已設(shè)置適當(dāng)對(duì)照，背景不需考慮時(shí)，也可省去此步。 
6.蛋白封閉。用含5%正常血清的緩沖液孵育20分鐘。或在10%的正常血清中孵育5-10分鐘。 
7.一抗。甩去多余封閉液，滴加適當(dāng)濃度的一抗（5%正常血清稀釋- VECTASTAIN® kit），室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)。在蒸餾水中清洗5分鐘。 
8.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
9.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需升高生物素化二抗的濃度。 
10.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
11.加入ABC復(fù)合物（預(yù)先制備的VECTASTAIN® ABC試劑）。孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需提高試劑濃度。 
12.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
13.底物。用適當(dāng)?shù)拿傅孜镞M(jìn)行孵育（可在顯微鏡下觀察至顯色最佳）。請(qǐng)根據(jù)底物試劑盒中推薦的時(shí)間做參考。 
14.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
15.（此步起，為對(duì)第2種抗原進(jìn)行染色標(biāo)記）Avidin/biotin封閉。此步可防止第2套標(biāo)記試劑與第1套標(biāo)記試劑相互作用。在蒸餾水中清洗5分鐘。 
16.蛋白封閉。用含5%正常血清的緩沖液孵育20分鐘。或在10%的正常血清中孵育5-10分鐘。用PBS洗2 分鐘/次×3次（也可使用其他緩沖液）。 
17.一抗。甩去多余封閉液，滴加適當(dāng)濃度的一抗（5%正常血清稀釋- VECTASTAIN® kit），室溫靜置1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí)（或適當(dāng)孵育時(shí)間）。 
18.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
19.二抗。滴加生物素化二抗，孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需升高生物素化二抗的濃度。 

20.加入ABC復(fù)合物（根據(jù)說明書預(yù)先制備的VECTASTAIN® ABC試劑）。孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需提高試劑濃度。 

21.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
22.底物。用適當(dāng)?shù)牡?/span>2種酶底物進(jìn)行孵育（可在顯微鏡下觀察至顯色最佳）。請(qǐng)根據(jù)底物試劑盒中推薦的時(shí)間做參考。 23.用自來水沖洗5分鐘。 
24.復(fù)染、鹽酸酒精分化、封片、鏡下觀察。

優(yōu)質(zhì)免疫化學(xué)檢測(cè)酶底物 
       Vector公司能提供過氧化物酶底物、堿性磷酸酶底物和葡萄糖氧化酶底物，以及DuoLuX 化學(xué)發(fā)光或熒光底物。可用于堿性磷酸酶，過氧化物酶和葡萄糖氧化酶。均為濃縮型，試劑盒內(nèi)包括能配置成300ml工作液所需的所有試劑成分，足以染色3000-6000張片。試劑盒成分穩(wěn)定，4℃可保存一年。酶底物反應(yīng)物有可溶性和非可溶性，適合IHC、WB、ISH、ELISA等多種免疫化學(xué)檢測(cè)方法。

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